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液体活检在淋巴瘤中的应用进展

液体活检在淋巴瘤中的应用进展
霍雨佳  赵维莅
  “液体活检”是通过血液样本检测肿瘤 DNA 的一种无创手段。肿瘤 DNA 在血液中以细胞形式即循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs)或者游 离 形 式 即 血 清 游 离 DNA (cell-free DNA,
cfDNA)被检测到。cfDNA 是细胞坏死或者凋亡之后进入血液 的 长 度 较 短(<200个 碱 基 对)的 双 链DNA,肿瘤组织和非肿瘤组织都可以产生cfDNA,其中肿瘤组织来源的 DNA 即 循 环 肿 瘤 DNA(cir-
culating-tumorDNA,ctDNA)〔1-2〕。随着测序技术
的不断进展,尤 其 是 二 代 测 序 技 术 的 兴 起,测 序 深度和质量得到了极大程度的提高,在许多肿瘤如肺癌、结 肠 癌、乳 腺 癌、黑 色 素 瘤 和 血 液 肿 瘤 中,
cfDNA/ctDNA 检测成为研究关注的焦点〔3-5〕。淋巴瘤是一种发病率最高的血液系统恶性肿瘤,由于淋巴瘤的分子异质性较强〔6〕,生物学行为更偏向实体瘤,cfDNA/ctDNA 检测在淋巴瘤中有着巨大的应用前景。目前常用的检测方法有3种,分别是聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)相关技术、高通量测序的克隆型免疫球蛋白重链基因重排(clonotypicimmunoglobulinheavychaingenerearrangementsbyHighThroughputSequencing,IgHTS)技术 和 基 因 组 合(panel)指导的二代测序技术(next-generationsequencing,NGS)(例 如:深度测序癌症个性化图谱)〔7〕。PCR相关技术通过引物来检测不同肿瘤中的特定ctDNA,试剂不能通用且检 测 的 基 因 种 类 受 限〔8-9〕。IgHTS 检 测 的ctDNA与组 织 检 测 的 突 变 相 比 敏 感 度 达 75% ~
88%,且具有通用试剂和价格低廉的特点〔10-13〕,但这项技术在低肿瘤负荷的患者中敏感度较低,并且只能应用于 B细胞淋巴瘤。Panel指 导 的 NGS测序技术是 目 前 应 用 最 广 的 方 式,能 够 显 示IgHTS不能显示出的驱动突变,文献报道的 panel基因种类为3~786个〔14-19〕。一 篇 系 统 分 析 显 示 从 中 抽取 13 个 常 见 基 因 即 STAT6,CD79B,MYD88,CD58,GNA13,MYC,CREBBP,BCL2,PIM1,
TP53,EZH2,MEF2B,B2M 组成的panel可以覆盖86.6%的患者〔20〕。本篇综述将讨论液体活检在不同类型淋巴瘤中的应用进展,对现今取得的成果和不足进行总结,希望让这项技术能够更好地服务临床工作。
  1 液体活检在弥漫大 B细胞淋巴瘤中的应用
  1.1 治疗前的风险预测作用
  首先,cfDNA 能 够 区 别 患 者 的 细 胞 起 源 (celloforigin,COO),非生发中心的比生发中心患者的cfDNA 含量高,EZH2和 BCL2在生发中心的弥漫大 B细胞淋巴瘤(DLBCL)中更常见,而 TNFAIP3
和 PIM1在非生发中心的 DLBCL 中更常见〔18,21〕。其次,不同研究证明,IPI评分4~5相较0~3,AnnArbor分期 3~4 相 较 1~2,乳 酸 脱 氢 酶 (lactatedehydrogenase,LDH)高,肿瘤代谢体积(metabolictumorvolume,MTV)高 的 患 者 ctDNA 明 显 增高〔15,19,21〕。Kurtz等〔17〕用 预 试 验 得 到 的 2.5loghGE/mL作为判断ctDNA 高 低 的 阈 值,得 出 在 一
线和挽救治疗 中,治 疗 前ctDNA 高 的 患 者2年 无病生存(event-freesurvival,EFS)率 显 著 低 于 治 疗前ctDNA 低 的 患 者;且 通 过 控 制 IPI、COO 和MTV,在初治患者的单因素和多因素分析模型中,治疗前ctDNA 可以预测患者的2年 EFS率,提示ctDNA 的 含 量 可 以 作 为 治 疗 前 判 断 DLBCL 患 者预后的指标。另外,DNA 甲基化在 DLBCL的发病过程中起到了重要作用,有研究评估了 DLBCL 中DNA 甲基化的水平,结果显示,作为整体低甲基化水平的标志,LINE1序 列 的 低 甲 基 化 水 平,在 DL-BCL患 者 中 与 较 低 的 5 年 总 体 生 存(overallsur-vival,OS)率 相 关〔22〕;而 以 往 发 现 的 DAPK1 和DBC1作为在 DLBCL 中被甲基化的抑癌基因,其高甲基化水平也与较低的5年 OS率相关〔23〕。
  1.2 治疗过程中的纵向监测作用
  目前,监测疗效的主要方法为影像学检查,但由于射线照射 等 原 因,使 用 次 数 受 限;同 时 正 电 子发 射 断 层 显 像 (positron emissiontomography-computedtomography,PET-CT)的 假 阳 性 率 有50%,假阴性 率 也 占 到 了30%〔24〕。最 早 的 研 究 发
现在随访的5年时间里,在第3个疗程第1天ctD-NA 阳 性 的 DLBCL 患 者 疾 病 进 展 时 间 (timetoprogression,TTP)为41.7%,相 比 较ctDNA 阴 性的患者 TTP 为80.2%有 显 著 差 异〔13〕。一 项 入 组了40例复发难治或者转化的 DLBCL 患者来探索帕罗司他联合利妥昔单抗疗效的研究发现,ctDNA在治疗第15天的水平就可以有效预测帕罗司他的应答 效 果〔14〕。Rossi等〔18〕对 新 诊 断 DLBCL 患 者的ctDNA 进行了纵向监测,结果发现,当患者对 R-CHOP应答不良时,初始血液中的突变不会消失;而当 R-CHOP方 案 有 效 时,血液中的初始突变在第2个疗程 就 会 快 速 地 下 降,提 示ctDNA 可 以 在治疗早期预测 治 疗 效 果。还 有 研 究 进 一 步 把ctD-NA 载量在第2个疗程前下降2-log称为早期分子应答(early molecularresponse,EMR),而 ctDNA在第3个 疗 程 前 下 降 2.5-log作为主要分子应答(majormolecularresponse,MMR)。在 2 个 验 证组中,达到 EMR或 MMR 的患者2年无进展生存(progressiontosurvival,PFS)率显著升高,但是只在用过挽救治疗的患者中2年 OS率显著升高〔17〕。相比于 PET-CT,ctDNA 预测的敏感度低(31% vs55%),特异度高(100%vs56%)〔12〕,提示我们在今后的临床 工 作 中 可 以 结 合 PET/CT 和ctDNA 来提高对残余病灶评估的准确性,标准有待更多临床试验的确定。
  然而,在一些治疗如造血干细胞移植(hemato-poieticstemcelltransplantation,HSCT)和嵌合抗原受体 T 细胞免疫疗法(chimericantigenreceptorT-cellimmunotherapy,CAR-T)中,及时的、长期的疗效监测显 得 更 为 重 要。一 项 采 集 了 患 者 移 植 后1,2,3,6,9,12,18,24个月或者复发后的血样的研究结果显示,3个月时ctDNA 阳性比ctDNA 阴性患者的2年 PFS率显著降低,且在19例移植后复发或者 进 展 的 患 者 中,17 例 (89%)患 者 在 之 前ctDNA 可以被检测到,中位时间为进展或者复发后
3.7个月〔10〕。最新发表的研究采集了6例 DLBCL患者在 CAR-T 回输前和回输后第0,7,14,21,28,56和90天的血浆进行ctDNA 的检测。结果显示,除1例第28天和3个月随访都为完全缓解的患者ctDNA 降到不可检测外,进展的 患 者ctDNA 的 水平都有升高。并且,一个亚 组 的2例 患 者 在 CAR-T 回输第7天 时 出 现 了ctDNA 的 峰 值,这 与 血 容量扩增的时间一致,也许提示着肿瘤的坏死〔11〕。这都印证了ctDNA 是一个十分敏感的指 标,有 助 于我们在治疗过程中早期干预,及时作出方案调整。
  同时,纵向监测作用还体现在监测治疗过程中出现的耐药,例如 BTK C481S监测伊布替尼 剂 耐药以及预测肿瘤转化。有研究发现最终转化为DLBCL的滤 泡 淋 巴 瘤 (follicularlymphoma,FL)在转化前 CARD11,PIM1等转化相关基因就存在;最后,TP53特定基因在一系列的ctDNA 标本中的含量对研究克隆演进也有很大价值〔19〕。
  1.3 治疗后监测缓解与复发
  一项入组 107 例 初 治 DLBCL 患 者 的 研 究 表明,ctDNA 从未被清除的患者到疾病进展的中位时间仅为3.8个月,而在长期缓解患者的近1000个
血样中,99.8%的样本ctDNA 完全清除〔13〕。
  综合以上结 果,Kurtz等〔25〕通 过 入 组2558例(其中132例 有ctDNA 的 数 据)DLBCL 患 者 进 行回顾性分析,确定了可以连续评估个体风险的指数(continuousindividualizedriskindex,CIRI),这一指数包括IPI评分,COO,中期影 像(interim PET-CT,iPET-CT)评 估 和 ctDNA 风 险 因 子 (治 疗 前ctDNA 水平,EMR 和 MMR)6个预测因素。结果显示,当分为<33%,33%~66%,>66%的3组风险预测时,CIRI可 以 很 好 地 在6个 疗 程 的 治 疗 中和24个月的监测期所有的时间点较好地预测患者的 PFS。
  2 液体活检在中枢神经系统淋巴瘤中的应用
  对于淋巴瘤的诊断,液体活检不能代替组织活检。然而某些 脑 部 的 病 灶,组 织 标 本 无 法 取 得,特别是脑脊液生化和流式的结果为阴性的情况下,我们很难对其进行诊断。MYD88L265P突变在原发中枢神经系统淋巴瘤(primarycentralnervoussys-temlymphoma,PCNSL)中 具 有 高 度 的 特 异 性,且在85%的 PCNSL 表 达〔26-27〕。日 本 学 者 对 14 例PCNSL的患者进行纵向监测,发 现 在 57.1%(8/
14)患 者 的 外 周 血 中 同 样 可 以 检 测 到 MYD88L265P突变,提示ctDNA 阳性应高度怀疑 PCNSL可能〔28〕。更有学者对 CNSL 患者的脑脊液进行了panel指导的检测,结果显示,7例缓解(完全缓解/部分缓解)患者第5个疗程前,cfDNA 为阴性,2个进展的 患 者 cfDNA 为 阳 性,并 且 有 1 例 患 者 在MRI和脑脊液细胞学阴性时就灵敏地检 测到了cfDNA 复现,提示了cfDNA 在 CNSL 的疗效预测的作用〔29〕。
  3 液体活检在其他类型淋巴瘤中的应用
  如前文所述,液体活检 可 以 在 DLBCL 中 作 为预后指标。最近,越来越多的学者把这一作用扩展到更多类型的淋巴瘤中〔30-32〕。研究通过纳入包括NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 (NK/Tcelllymphoma,NK/TCL),霍 奇 金 淋 巴 瘤(Hodgkinlymphoma,HL),FL,DLBCL等共60例淋巴瘤患者,得出cfDNA 含量和cfDNA 完整性与 ECOG 评分,LDH 水平,IPI评分,B症状,Ki-67表 达 相 关,但与是否为大包块不相关;在cfDNA 作为治疗效果的预测因素 ROC分析中,cfDNA 的含量(0.8683,95%CI0.8077~0.9290)和完整性(0.8785,95%CI0.8203~0.9368)都 优 于 LDH(0.7649,95%CI0.6948~0.8350)〔32〕。而前文 提 到cfDNA 的 含 量 在 non-GCB 亚型中 显 著 高 于 GCB 亚 型,也 引 导 研 究 者 检 测 到NK/TCL中cfDNA 的 含 量 和 突 变 等 位 基 因 频 率(mutantallelefrequency,MAF)明显高于DLBCL,这提示在侵袭性更高的淋巴瘤类型中cfDNA 的含量可能更高〔21〕。
  经 典 型 霍 奇 金 淋 巴 瘤 (classic Hodgkinlym-phoma,cHL)是一类以镜影细胞 (HodgkinReed-stainberg,HRS)为特征的淋巴瘤。因为 HRS细胞在组织中分布较少,传统基因检测方法必须通过细胞富集技术来实现,而 panel指导的 NGS技术,可以方 便 快 捷 地 检 测 ctDNA,灵 敏 度 高 达 87%〔33〕。一项入组了112例初治或者复发难治的cHL 患者的研究发现,在24例进展的患者中,与治疗2个周
期后ctDNA 载 量 较 初 始 下 降 小 于2log的 患 者 相比,大于2log的患者 PFS显著降低,进而提出ctD-NA 可以和 PET-CT 结合作为早期确认cHL 患者对化疗反应的指标〔33〕。T 细胞淋巴瘤约占非霍奇金淋 巴 瘤 的10%~15%,相比于 B细胞淋巴瘤,其疾病进展迅猛,生存率明显降低,所以及时准确的诊断和疗效评估是十分重要的。一项日本的研究率先尝试了测定14例血管免疫 母 性 T 细 胞 淋 巴 瘤(angioimmunoblasticTcelllymphoma,AITL)患者外周血中文献报道多发的 TET2,G17V RHOA,IDH2,DNMT3四个基因,与组织基因检测相比总体灵敏度达83%,其中G17V RHOA 基因的灵敏度和 特异度均高达100%,提示可 以 作 为 诊 断 疾 病 的 指 标。在 预 测 疗效方面,1例接受 CHOP方案治疗的患者在第2个疗程后和治疗结束以后所有 cfDNA 突 变 都 消 失了,最后评估结果为完全缓解〔34〕。但由于样本量较小,其研究结果尚需更大样本量的临床试验的证实。
  综上所述,液体活检作为一项无创、安全、简便易得的检测 手 段,在不同类型淋巴瘤的风险预测、疗效评估、靶 向 用 药、长 期 监 测 疾 病 状 态 等 方 面 有着广泛的应用和巨大的发展潜力。但是,研究结果尚存在一些方面的不足。第一,有些研究纳入的病例数较少,说服力不强;第二,不同研究运用的检测方法 不 统 一,基 因 组 合 中 的 基 因 种 类 和 数 目 不 统一,导致结果 会 有 偏 差。所 以,完 善 检 测 技 术 并 开展规范的大样本的回顾性以及前瞻性临床试验 势在必行,希望将来的液体活检技术在临床上更加准确,敏感和高效。
  
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