霍雨佳  赵维莅

  “液体活检”是通过血液样本检测肿瘤 ＤＮＡ 的一种无创手段。肿瘤 ＤＮＡ 在血液中以细胞形式即循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）或者游 离 形 式 即 血 清 游 离 ＤＮＡ （ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ，
ｃｆＤＮＡ）被检测到。ｃｆＤＮＡ 是细胞坏死或者凋亡之后进入血液 的 长 度 较 短（＜２００个 碱 基 对）的 双 链ＤＮＡ，肿瘤组织和非肿瘤组织都可以产生ｃｆＤＮＡ，其中肿瘤组织来源的 ＤＮＡ 即 循 环 肿 瘤 ＤＮＡ（ｃｉｒ－
ｃｕｌａｔｉｎｇ－ｔｕｍｏｒＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）〔１－２〕。随着测序技术
的不断进展，尤 其 是 二 代 测 序 技 术 的 兴 起，测 序 深度和质量得到了极大程度的提高，在许多肿瘤如肺癌、结 肠 癌、乳 腺 癌、黑 色 素 瘤 和 血 液 肿 瘤 中，
ｃｆＤＮＡ／ｃｔＤＮＡ 检测成为研究关注的焦点〔３－５〕。淋巴瘤是一种发病率最高的血液系统恶性肿瘤，由于淋巴瘤的分子异质性较强〔６〕，生物学行为更偏向实体瘤，ｃｆＤＮＡ／ｃｔＤＮＡ 检测在淋巴瘤中有着巨大的应用前景。目前常用的检测方法有３种，分别是聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）相关技术、高通量测序的克隆型免疫球蛋白重链基因重排（ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎｇｅｎｅｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓｂｙＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＩｇＨＴＳ）技术 和 基 因 组 合（ｐａｎｅｌ）指导的二代测序技术（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）（例 如：深度测序癌症个性化图谱）〔７〕。ＰＣＲ相关技术通过引物来检测不同肿瘤中的特定ｃｔＤＮＡ，试剂不能通用且检 测 的 基 因 种 类 受 限〔８－９〕。ＩｇＨＴＳ 检 测 的ｃｔＤＮＡ与组 织 检 测 的 突 变 相 比 敏 感 度 达 ７５％ ～
８８％，且具有通用试剂和价格低廉的特点〔１０－１３〕，但这项技术在低肿瘤负荷的患者中敏感度较低，并且只能应用于 Ｂ细胞淋巴瘤。Ｐａｎｅｌ指 导 的 ＮＧＳ测序技术是 目 前 应 用 最 广 的 方 式，能 够 显 示ＩｇＨＴＳ不能显示出的驱动突变，文献报道的 ｐａｎｅｌ基因种类为３～７８６个〔１４－１９〕。一 篇 系 统 分 析 显 示 从 中 抽取 １３ 个 常 见 基 因 即 ＳＴＡＴ６，ＣＤ７９Ｂ，ＭＹＤ８８，ＣＤ５８，ＧＮＡ１３，ＭＹＣ，ＣＲＥＢＢＰ，ＢＣＬ２，ＰＩＭ１，
ＴＰ５３，ＥＺＨ２，ＭＥＦ２Ｂ，Ｂ２Ｍ 组成的ｐａｎｅｌ可以覆盖８６．６％的患者〔２０〕。本篇综述将讨论液体活检在不同类型淋巴瘤中的应用进展，对现今取得的成果和不足进行总结，希望让这项技术能够更好地服务临床工作。
  １ 液体活检在弥漫大 Ｂ细胞淋巴瘤中的应用
  １．１ 治疗前的风险预测作用
  首先，ｃｆＤＮＡ 能 够 区 别 患 者 的 细 胞 起 源 （ｃｅｌｌｏｆｏｒｉｇｉｎ，ＣＯＯ），非生发中心的比生发中心患者的ｃｆＤＮＡ 含量高，ＥＺＨ２和 ＢＣＬ２在生发中心的弥漫大 Ｂ细胞淋巴瘤（ＤＬＢＣＬ）中更常见，而 ＴＮＦＡＩＰ３
和 ＰＩＭ１在非生发中心的 ＤＬＢＣＬ 中更常见〔１８，２１〕。其次，不同研究证明，ＩＰＩ评分４～５相较０～３，ＡｎｎＡｒｂｏｒ分期 ３～４ 相 较 １～２，乳 酸 脱 氢 酶 （ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ）高，肿瘤代谢体积（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｔｕｍｏｒｖｏｌｕｍｅ，ＭＴＶ）高 的 患 者 ｃｔＤＮＡ 明 显 增高〔１５，１９，２１〕。Ｋｕｒｔｚ等〔１７〕用 预 试 验 得 到 的 ２．５ｌｏｇｈＧＥ／ｍＬ作为判断ｃｔＤＮＡ 高 低 的 阈 值，得 出 在 一
线和挽救治疗 中，治 疗 前ｃｔＤＮＡ 高 的 患 者２年 无病生存（ｅｖｅｎｔ－ｆｒｅｅｓｕｒｖｉｖａｌ，ＥＦＳ）率 显 著 低 于 治 疗前ｃｔＤＮＡ 低 的 患 者；且 通 过 控 制 ＩＰＩ、ＣＯＯ 和ＭＴＶ，在初治患者的单因素和多因素分析模型中，治疗前ｃｔＤＮＡ 可以预测患者的２年 ＥＦＳ率，提示ｃｔＤＮＡ 的 含 量 可 以 作 为 治 疗 前 判 断 ＤＬＢＣＬ 患 者预后的指标。另外，ＤＮＡ 甲基化在 ＤＬＢＣＬ的发病过程中起到了重要作用，有研究评估了 ＤＬＢＣＬ 中ＤＮＡ 甲基化的水平，结果显示，作为整体低甲基化水平的标志，ＬＩＮＥ１序 列 的 低 甲 基 化 水 平，在 ＤＬ－ＢＣＬ患 者 中 与 较 低 的 ５ 年 总 体 生 存（ｏｖｅｒａｌｌｓｕｒ－ｖｉｖａｌ，ＯＳ）率 相 关〔２２〕；而 以 往 发 现 的 ＤＡＰＫ１ 和ＤＢＣ１作为在 ＤＬＢＣＬ 中被甲基化的抑癌基因，其高甲基化水平也与较低的５年 ＯＳ率相关〔２３〕。
  １．２ 治疗过程中的纵向监测作用
  目前，监测疗效的主要方法为影像学检查，但由于射线照射 等 原 因，使 用 次 数 受 限；同 时 正 电 子发 射 断 层 显 像 （ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ－ｃｏｍｐｕｔｅｄｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，ＰＥＴ－ＣＴ）的 假 阳 性 率 有５０％，假阴性 率 也 占 到 了３０％〔２４〕。最 早 的 研 究 发
现在随访的５年时间里，在第３个疗程第１天ｃｔＤ－ＮＡ 阳 性 的 ＤＬＢＣＬ 患 者 疾 病 进 展 时 间 （ｔｉｍｅｔｏｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ＴＴＰ）为４１．７％，相 比 较ｃｔＤＮＡ 阴 性的患者 ＴＴＰ 为８０．２％有 显 著 差 异〔１３〕。一 项 入 组了４０例复发难治或者转化的 ＤＬＢＣＬ 患者来探索帕罗司他联合利妥昔单抗疗效的研究发现，ｃｔＤＮＡ在治疗第１５天的水平就可以有效预测帕罗司他的应答 效 果〔１４〕。Ｒｏｓｓｉ等〔１８〕对 新 诊 断 ＤＬＢＣＬ 患 者的ｃｔＤＮＡ 进行了纵向监测，结果发现，当患者对 Ｒ－ＣＨＯＰ应答不良时，初始血液中的突变不会消失；而当 Ｒ－ＣＨＯＰ方 案 有 效 时，血液中的初始突变在第２个疗程 就 会 快 速 地 下 降，提 示ｃｔＤＮＡ 可 以 在治疗早期预测 治 疗 效 果。还 有 研 究 进 一 步 把ｃｔＤ－ＮＡ 载量在第２个疗程前下降２－ｌｏｇ称为早期分子应答（ｅａｒｌｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＥＭＲ），而 ｃｔＤＮＡ在第３个 疗 程 前 下 降 ２．５－ｌｏｇ作为主要分子应答（ｍａｊｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＭＭＲ）。在 ２ 个 验 证组中，达到 ＥＭＲ或 ＭＭＲ 的患者２年无进展生存（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｔｏｓｕｒｖｉｖａｌ，ＰＦＳ）率显著升高，但是只在用过挽救治疗的患者中２年 ＯＳ率显著升高〔１７〕。相比于 ＰＥＴ－ＣＴ，ｃｔＤＮＡ 预测的敏感度低（３１％ ｖｓ５５％），特异度高（１００％ｖｓ５６％）〔１２〕，提示我们在今后的临床 工 作 中 可 以 结 合 ＰＥＴ／ＣＴ 和ｃｔＤＮＡ 来提高对残余病灶评估的准确性，标准有待更多临床试验的确定。
  然而，在一些治疗如造血干细胞移植（ｈｅｍａｔｏ－ｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＨＳＣＴ）和嵌合抗原受体 Ｔ 细胞免疫疗法（ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒＴ－ｃｅｌｌｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＣＡＲ－Ｔ）中，及时的、长期的疗效监测显 得 更 为 重 要。一 项 采 集 了 患 者 移 植 后１，２，３，６，９，１２，１８，２４个月或者复发后的血样的研究结果显示，３个月时ｃｔＤＮＡ 阳性比ｃｔＤＮＡ 阴性患者的２年 ＰＦＳ率显著降低，且在１９例移植后复发或者 进 展 的 患 者 中，１７ 例 （８９％）患 者 在 之 前ｃｔＤＮＡ 可以被检测到，中位时间为进展或者复发后
３．７个月〔１０〕。最新发表的研究采集了６例 ＤＬＢＣＬ患者在 ＣＡＲ－Ｔ 回输前和回输后第０，７，１４，２１，２８，５６和９０天的血浆进行ｃｔＤＮＡ 的检测。结果显示，除１例第２８天和３个月随访都为完全缓解的患者ｃｔＤＮＡ 降到不可检测外，进展的 患 者ｃｔＤＮＡ 的 水平都有升高。并且，一个亚 组 的２例 患 者 在 ＣＡＲ－Ｔ 回输第７天 时 出 现 了ｃｔＤＮＡ 的 峰 值，这 与 血 容量扩增的时间一致，也许提示着肿瘤的坏死〔１１〕。这都印证了ｃｔＤＮＡ 是一个十分敏感的指 标，有 助 于我们在治疗过程中早期干预，及时作出方案调整。
  同时，纵向监测作用还体现在监测治疗过程中出现的耐药，例如 ＢＴＫ Ｃ４８１Ｓ监测伊布替尼 剂 耐药以及预测肿瘤转化。有研究发现最终转化为ＤＬＢＣＬ的滤 泡 淋 巴 瘤 （ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｌｙｍｐｈｏｍａ，ＦＬ）在转化前 ＣＡＲＤ１１，ＰＩＭ１等转化相关基因就存在；最后，ＴＰ５３特定基因在一系列的ｃｔＤＮＡ 标本中的含量对研究克隆演进也有很大价值〔１９〕。
  １．３ 治疗后监测缓解与复发
  一项入组 １０７ 例 初 治 ＤＬＢＣＬ 患 者 的 研 究 表明，ｃｔＤＮＡ 从未被清除的患者到疾病进展的中位时间仅为３．８个月，而在长期缓解患者的近１０００个
血样中，９９．８％的样本ｃｔＤＮＡ 完全清除〔１３〕。
  综合以上结 果，Ｋｕｒｔｚ等〔２５〕通 过 入 组２５５８例（其中１３２例 有ｃｔＤＮＡ 的 数 据）ＤＬＢＣＬ 患 者 进 行回顾性分析，确定了可以连续评估个体风险的指数（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄｒｉｓｋｉｎｄｅｘ，ＣＩＲＩ），这一指数包括ＩＰＩ评分，ＣＯＯ，中期影 像（ｉｎｔｅｒｉｍ ＰＥＴ－ＣＴ，ｉＰＥＴ－ＣＴ）评 估 和 ｃｔＤＮＡ 风 险 因 子 （治 疗 前ｃｔＤＮＡ 水平，ＥＭＲ 和 ＭＭＲ）６个预测因素。结果显示，当分为＜３３％，３３％～６６％，＞６６％的３组风险预测时，ＣＩＲＩ可 以 很 好 地 在６个 疗 程 的 治 疗 中和２４个月的监测期所有的时间点较好地预测患者的 ＰＦＳ。
  ２ 液体活检在中枢神经系统淋巴瘤中的应用
  对于淋巴瘤的诊断，液体活检不能代替组织活检。然而某些 脑 部 的 病 灶，组 织 标 本 无 法 取 得，特别是脑脊液生化和流式的结果为阴性的情况下，我们很难对其进行诊断。ＭＹＤ８８Ｌ２６５Ｐ突变在原发中枢神经系统淋巴瘤（ｐｒｉｍａｒｙｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓ－ｔｅｍｌｙｍｐｈｏｍａ，ＰＣＮＳＬ）中 具 有 高 度 的 特 异 性，且在８５％的 ＰＣＮＳＬ 表 达〔２６－２７〕。日 本 学 者 对 １４ 例ＰＣＮＳＬ的患者进行纵向监测，发 现 在 ５７．１％（８／
１４）患 者 的 外 周 血 中 同 样 可 以 检 测 到 ＭＹＤ８８Ｌ２６５Ｐ突变，提示ｃｔＤＮＡ 阳性应高度怀疑 ＰＣＮＳＬ可能〔２８〕。更有学者对 ＣＮＳＬ 患者的脑脊液进行了ｐａｎｅｌ指导的检测，结果显示，７例缓解（完全缓解／部分缓解）患者第５个疗程前，ｃｆＤＮＡ 为阴性，２个进展的 患 者 ｃｆＤＮＡ 为 阳 性，并 且 有 １ 例 患 者 在ＭＲＩ和脑脊液细胞学阴性时就灵敏地检 测到了ｃｆＤＮＡ 复现，提示了ｃｆＤＮＡ 在 ＣＮＳＬ 的疗效预测的作用〔２９〕。

  ３ 液体活检在其他类型淋巴瘤中的应用
  如前文所述，液体活检 可 以 在 ＤＬＢＣＬ 中 作 为预后指标。最近，越来越多的学者把这一作用扩展到更多类型的淋巴瘤中〔３０－３２〕。研究通过纳入包括ＮＫ／Ｔ 细 胞 淋 巴 瘤 （ＮＫ／Ｔｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ，ＮＫ／ＴＣＬ），霍 奇 金 淋 巴 瘤（Ｈｏｄｇｋｉｎｌｙｍｐｈｏｍａ，ＨＬ），ＦＬ，ＤＬＢＣＬ等共６０例淋巴瘤患者，得出ｃｆＤＮＡ 含量和ｃｆＤＮＡ 完整性与 ＥＣＯＧ 评分，ＬＤＨ 水平，ＩＰＩ评分，Ｂ症状，Ｋｉ－６７表 达 相 关，但与是否为大包块不相关；在ｃｆＤＮＡ 作为治疗效果的预测因素 ＲＯＣ分析中，ｃｆＤＮＡ 的含量（０．８６８３，９５％ＣＩ０．８０７７～０．９２９０）和完整性（０．８７８５，９５％ＣＩ０．８２０３～０．９３６８）都 优 于 ＬＤＨ（０．７６４９，９５％ＣＩ０．６９４８～０．８３５０）〔３２〕。而前文 提 到ｃｆＤＮＡ 的 含 量 在 ｎｏｎ－ＧＣＢ 亚型中 显 著 高 于 ＧＣＢ 亚 型，也 引 导 研 究 者 检 测 到ＮＫ／ＴＣＬ中ｃｆＤＮＡ 的 含 量 和 突 变 等 位 基 因 频 率（ｍｕｔａｎｔａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ＭＡＦ）明显高于ＤＬＢＣＬ，这提示在侵袭性更高的淋巴瘤类型中ｃｆＤＮＡ 的含量可能更高〔２１〕。
  经 典 型 霍 奇 金 淋 巴 瘤 （ｃｌａｓｓｉｃ Ｈｏｄｇｋｉｎｌｙｍ－ｐｈｏｍａ，ｃＨＬ）是一类以镜影细胞 （ＨｏｄｇｋｉｎＲｅｅｄ－ｓｔａｉｎｂｅｒｇ，ＨＲＳ）为特征的淋巴瘤。因为 ＨＲＳ细胞在组织中分布较少，传统基因检测方法必须通过细胞富集技术来实现，而 ｐａｎｅｌ指导的 ＮＧＳ技术，可以方 便 快 捷 地 检 测 ｃｔＤＮＡ，灵 敏 度 高 达 ８７％〔３３〕。一项入组了１１２例初治或者复发难治的ｃＨＬ 患者的研究发现，在２４例进展的患者中，与治疗２个周
期后ｃｔＤＮＡ 载 量 较 初 始 下 降 小 于２ｌｏｇ的 患 者 相比，大于２ｌｏｇ的患者 ＰＦＳ显著降低，进而提出ｃｔＤ－ＮＡ 可以和 ＰＥＴ－ＣＴ 结合作为早期确认ｃＨＬ 患者对化疗反应的指标〔３３〕。Ｔ 细胞淋巴瘤约占非霍奇金淋 巴 瘤 的１０％～１５％，相比于 Ｂ细胞淋巴瘤，其疾病进展迅猛，生存率明显降低，所以及时准确的诊断和疗效评估是十分重要的。一项日本的研究率先尝试了测定１４例血管免疫 母 性 Ｔ 细 胞 淋 巴 瘤（ａｎｇｉｏｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃＴｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ，ＡＩＴＬ）患者外周血中文献报道多发的 ＴＥＴ２，Ｇ１７Ｖ ＲＨＯＡ，ＩＤＨ２，ＤＮＭＴ３四个基因，与组织基因检测相比总体灵敏度达８３％，其中Ｇ１７Ｖ ＲＨＯＡ 基因的灵敏度和 特异度均高达１００％，提示可 以 作 为 诊 断 疾 病 的 指 标。在 预 测 疗效方面，１例接受 ＣＨＯＰ方案治疗的患者在第２个疗程后和治疗结束以后所有 ｃｆＤＮＡ 突 变 都 消 失了，最后评估结果为完全缓解〔３４〕。但由于样本量较小，其研究结果尚需更大样本量的临床试验的证实。
  综上所述，液体活检作为一项无创、安全、简便易得的检测 手 段，在不同类型淋巴瘤的风险预测、疗效评估、靶 向 用 药、长 期 监 测 疾 病 状 态 等 方 面 有着广泛的应用和巨大的发展潜力。但是，研究结果尚存在一些方面的不足。第一，有些研究纳入的病例数较少，说服力不强；第二，不同研究运用的检测方法 不 统 一，基 因 组 合 中 的 基 因 种 类 和 数 目 不 统一，导致结果 会 有 偏 差。所 以，完 善 检 测 技 术 并 开展规范的大样本的回顾性以及前瞻性临床试验 势在必行，希望将来的液体活检技术在临床上更加准确，敏感和高效。