第1篇：延缓寄生虫恶性疟原虫产生的研究

疟疾（Malaria)是全球性严重危害人类健康的重要传染病之一，目前全球有90多个国家和地区的20多亿人居住在疟疾流行区。撒哈拉以南的非洲国家感染疟疾疫情最重，疟疾是非洲儿童死亡的最主要原因之一。东南亚的感染情况仅次于非洲，据世界卫生组织2008年的报告，全球30%的疟疾发病率和8%的死亡率集中在这里。虽然2010年世界卫生组织报告：疟疾发病案例由2005年2.44亿人次降到2009年2.25亿人次；死亡人数由2000年98.5万例降到2009年的78.1万例，其中非洲地区死亡人数虽然大幅下降，但是目前疟疾仍然是世界六大热带病和我国五大寄生虫病之一，是威胁人类健康的主要疾病，给疫区带来沉重的经济负担，阻碍社会的发展。由于恶性疟发病凶险，愈后差，其病死率可高达50%，并且恶性疟原虫对多种抗疟药已存在耐药性，因此恶性疟已经成为一个严重的公共卫生问题。

自上世纪60年代以来，全球范围内恶性疟原虫对主要抗疟药物氯喹产生了抗药性，疟原虫的抗药性由单一性向多药抗性发展。恶性疟原虫抗药株的不断出现已成为重大的公共卫生问题，给疟疾防治工作带来新的挑战，疟原虫抗药性研究迫在眉睫。鉴于全球恶性疟原虫对传统的氯喹、乙胺嘧啶、甲氟喹等已产生耐药，由于具有抗药性疟原虫会很快遍布所有恶性疟流行地区，抗药强度会不断增加，原虫产生抗药性的速度远比新药研发的进度快得多，从保护青蒿素及其衍生物的角度考虑，世界卫生组织建议各国在青蒿素及其衍生物的基础上联合其他药物（ACTs)来治疗恶性疟，以延缓疟原虫对青蒿素和其他药物抗药性的产生。

1青蒿素类药物抗药性的现状

青蒿素及其衍生物是一类全新结构的抗疟药，自其问世以来即以高效、速效、低毒的抗疟活性得到世界公认，对氯喹耐药的恶性疟依然有效。现在多重抗药的恶性疟原虫株已在东南亚和南美洲等地广泛流行，虽然疟原虫已对多种药物产生了抗药性，青蒿素类药物仍能够在几天内治愈超过90%的疟疾患者，目前被全世界公认为是一种很有效的抗疟新药，但是目前已有很多的研究提示青蒿素类药物的敏感性正逐渐下降，抗药性的产生是难以避免的。世界卫生组织曾经警告说，如果失去了ACTs，人们将再也没有一个治疗疟疾的办法，或许至少要用十年的时间才能发现一种新的抗疟药。

迄今为止，还没有文献报道恶性疟原虫对青蒿素类药物出现普遍的耐药性，但有报道称用青蒿素类药物治疗病人时已经出现了敏感性下降，寄生虫清除时间出现延迟和几周后再燃等情况。最近在柬埔寨西部的Pailin和泰国WangPha同时做了—项治疗无并发症的恶性疟患者的研究，分为青蒿琥酯单药组和青蒿琥酯联用甲氟喹组两组，单药治疗组青蒿琥酯的剂量为2mg/kg，d共7d，联用组青蒿琥酯4mg/kg，d共3d，以后给甲氟喹25mg/kg，分两次给药。在柬埔寨的Pailin寄生虫清除时间为84h，泰国WangPha，为48h，在过去几十年的经验表明青蒿素类的药物可在两天时间内迅速清除血液寄生虫。排除了再次感染，在两地单用青蒿琥酯治疗组几周内分别有30%和10%的患者出现了症状复发的情况，而联合治疗组分别有10%和5%的病人再燃。Pailin和WangPha真正的失败率可能分别高达20.0%和37.5%。2004年柬埔寨第1次报告用青蒿素治疗恶性疟出现耐药以来，许多在泰国一缅甸边境上出现的“新感染疟疾”病例，实际上很可能是再燃。在缅甸南部还有另一项研究对青蒿琥酯治疗无并发症疟疾患者，治疗72h后进行寄生虫清除半衰期的分析，表明72h后有26.9%仍可检测出原虫。这是第一次报告青蒿素耐药性起源在缅甸境内，这些研究提供的证据表明在缅甸的恶性疟原虫很可能对青蒿素敏感性降低。在泰国边境，甲氟喹，青蒿琥酯在体内的疗效逐步下降，有研究报告用青蒿琥酯治疗恶性疟病人，治疗第3d患者的外周血疟原虫阳性率2011年达到28%，而2000年同样用青蒿琥酯治疗病人，3d后患者外周血疟原虫阳性率为0%。恶性疟原虫于青蒿素类药物治疗3d后血液中仍然可以观察到较多寄生虫，这就是“延迟疟原虫转阴时间”。还有研究表明，经过在泰国青蒿素治疗后第2d、第3d可见疟原虫的比例约30%和15%，第28d有2%可见疟原虫。柬埔寨西部的Pailin，患者经青蒿琥酯单药治疗或甲氟喹，青蒿琥酯治疗2d后外周血涂片见寄生虫的比例高达73%，治疗3d后患者外周血涂片见到疟原虫的比例为55%。疟原虫清除时间延长在越南也有报道，但相关研究仍在继续，有待于进一步监测及证实。

恶性疟原虫对青蒿素类药物出现敏感性降低的现象在亚洲比较突出，而在非洲则不同。在西非马里共和国（R6publiqueduMali)的研究指出，在这项青蒿素耐药性的研究患者外周血中疟原虫转阴时间的中位数为32h，远低于柬埔寨西部报告时间。可能的原因为马里2004年以后才广泛使用青蒿素类药物，而柬埔寨使用这类药物超过30年，在马里疟疾病人得到青蒿素及衍生物治疗的比例远低于柬埔寨西部，另外马里大量恶性疟疾病例主要为输入性病例，病人不会自行用药，这些因素可能使得马里的疟原虫未对青蒿素类药物长沙耐药。

2009年杨恒林等采用WHO推荐的体外微量法做了缅甸拉咱地区恶性疟原虫对青蒿琥酯等7种药物体外半数抑制量（ID5。）测定，发现缅甸拉咱地区恶性疟原虫对青蒿琥酯的ID5。为299.2nM/L比1993年作者在该地区做的IC50上升1.2倍，提示青蒿琥酯对恶性的敏感性呈下降趋势。另一项研究用双氢青蒿素脉喹片（每片含双氢青蒿素40mg，磷酸脉喹320mg)2d4次疗法治疗缅甸拉咱市恶性疟原虫感染阳性者91例，64例全程随访者中，尚有4例（6.3%)于服药后第3d外周血中疟原虫未转阴，但因这4例病人腋温小于37.5°C仍判为临床治疗有效，这4例患者服药后随访外周血无性体原虫转阴时间为65.9h，比研究者在云南观察的最长无性体原虫转阴时间（63h)长，这可能与当地恶性疟原虫对脉喹和青蒿素类敏感性下降有关，推测当地部分恶性疟原虫可能对双氢青蒿素脉喹片敏感性下降。

2青蒿素类药物抗药性可能的机理

耐多种抗疟药的恶性疟原虫是全球疟疾控制的—个主要障碍。虽然青蒿素类药物抗性关联基因研究被人们进行很多探索，但是到现在为止仍然没有明确的结论。恶性疟原虫耐抗疟药乙胺嘧啶、磺胺、氯陆与特定的汐外和一P/cri基因突变相关。然而，有相当大的争议为新兴突变的耐青蒿素类抗疟药衍生药物标记。一些观察表明青蒿素抑制恶性疟原虫胞浆网织钙依赖性ATP酶（sarco/endoplasmiccalcium-dependentATPase6，P/AT-，有资料表明，青蒿素类药物可以抑制在非洲爪蟾卵细胞内表达P/a^6的酶活性，如果在该酶的第三跨膜区引入L263E这一突变，则解除了青蒿素类药物对该酶的抑制。jamb〇u等，报道了位于沿巴西北部边境的圭亚那从恶性疟患者体内分离出的虫株对蒿甲醚的IC5D值有所升高，通过测序，他们发现P一/a^6的第769位的丝氨酸突变为天冬酰胺，提示P一/a^6基因的突变可能会使疟原虫对青蒿素的敏感性降低。虽然这种突变的意义还未确定，这些观察可能表明S769N突变可能是一个药物抗性标记。值得注意的是，大部分的P/a^6突变是具有地域局限的。现仍需要进一步的研究，找出能够可靠预测的青蒿素耐药性的分子标记。目前，对这个观点持否定态度的有所增加。

2010年美国的一个学者提出，ACT(artemisi-nincombinationtherapy)疗效的下降，和P/TO<ir1基因型有关。A/?dr1的基因拷贝数增加，不论在体内还是体外实验，都是甲氟喹和卤泛群的抗性的主要决定因子[19]。在东南亚，特别是泰国和柬埔寨的一些地区，高水平的分离与f/mcr1拷贝数大于1(30%～40%)是由于MQ单药治疗多年，作为第一线治疗无并发症恶性疟疾。抗疟疾药物滥用可能导致株扩增A/^T1的患病率快速增加，因为所有疟疾流行地区，疟疾在非洲的传输水平是最高的。这种情况可能加速耐药性的出现行为[24]。作为一个概念证明，研究者用7d的本芴醇浓度测量估计再感染成倍增加恶性疟原虫浓度，多药耐药基因(f/mr1)基因型与药敏的结果。研究结果发现，再次感染寄生虫f/rnr1单体型的N86/184F/D1246种能够承受本芴醇血药浓度高于15倍那些与86Y/Y184/1246Y的单倍型。该方法可应用于长半衰期抗疟疾药物，能及早发现恶性疟原虫体内的药物敏感性降低，这代表一种新的抗疟药耐药的分子标记方式。

到今天为止，上述观点仍一直存在争议，分子基础耐药机制仍不清楚。柬埔寨泰国边境上出现的青蒿素耐药性的威胁已得到广泛承认，虽然最终明确的恶性疟原虫感染，大多数仍然以青蒿素为基础的联合疗法治疗，耐药的恶性疟原虫清除时间需要3或4d，而青蒿素敏感的疟原虫虫清除时间不到2d。防止青蒿素耐药性的蔓延是疟疾防治的重大课题。

有报道指出，在柬埔寨西部青蒿琥酯治疗恶性疟疾的失败率增加，也就是说青蒿素类药物已经被发现敏感性下降，其可能的机制是寄生虫生长休眠情况。休眠恢复假说为寄生虫在人体内经过药物作用后进入静止状态或者休眠，等青蒿素类药物的短的药物药效高峰期过了以后，才进一步发育，这样的一个发育滞后，怡怡保护他们免受药物致死效果。最近有研究表明，在双氢青蒿素作用下恶性疟原虫很容易进入休眠期。与其他药物相比，较长半衰期的药物则不容易进入休眠期。法国和美国科学家亦发表了类似研究结果。

休眠现象实际就是寄生虫的一种自我保护现象。对于恶性疟原虫来说，其表现就是恶性疟原虫在人体内的清除延迟。尽管清除延迟一直使原虫复燃的风险增高，但临床疟疾却没有体现出治疗失败现象。

如果确定休眠现象是青蒿素耐药性真正的原因，我们在临床治疗时，就可以根据此机制更灵活的运用并治疗。休眠现象被认为更多的存在于短期疗效的药物中，此时我们的治疗就可以青蒿素短期疗效结合长效药，以这样的联合用药为治疗的主导地位。

3结语

疟疾在全球致死性寄生虫病中位居第一位。青蒿素类药物作为一种全新抗疟药，以其优良的疗效和低毒性而成为全世界最常用的抗疟药。世界已有多个地区报道恶性疟原虫对青蒿素类药物的敏感性下降，寄生虫在人体内清除率时间延长。让从事疟疾防治的工作者真正认识到恶性疟原虫对青蒿素产生抗药性的危害，对延缓疟原虫对青蒿素类药物耐药产生意义重大。

虽然青蒿素耐药性机制近期被多方研究探索，如P/a^6基因突变、P一/ror1基因突变，以及研究最热的寄生虫休眠假说等等，但是到现在仍然没有确定，有待进一步的研究探索，解开青蒿素耐药之谜，延长青蒿素类药物使用寿命和减缓耐药性，使疟疾的治疗没有后顾之忧。

作者：王颖娜1，张艳梅2，蔺应学3，杨照青1（1.昆明医科大学寄生虫学教研室，昆明650500；2.昆明医科大学第一附属医院传染科，昆明650500）

第2篇：影响恶性寄生虫疟原虫红内期连续培养的因素

体外培养疟原虫的工作始于本世纪初。最早从事这项工作的是Bass和Johns，1912年他们报道了在加有葡萄糖的全血内观察到恶性疟原虫可以从环状体发育到裂殖体。接着人们试图建立疟原虫红内期的连续培养，但一直到60年后，这一努力才获得成功。两个独立的研究组分别报道了恶性疟原虫在体外连续培养成功，其中特别是Trager和Jen?sen的方法对于人疟的研究有着划时代的意义，使各国科学工作者有机会从事临床上最重要的疟原虫的研究工作，同时也为研究疟疾的生物化学、寄生虫学、免疫学和化学治疗奠定了基础。

虽然在60年代已能进行鸟疟的红外期的连续培养，但晡乳动物红外期培养一直到1981年才获得成功》对伯氏疟方面的这些研究目前也已应用于人类间日疟原虫的红外期培养，疟原虫孢子增殖各期均能在体外发育，成熟的有感染性的配子体也可从体外培养得到。但完整的连续的孢子增殖阶段的体外培养至今尚未成功，红内期无性体的体外培养。

一、体外培养疟原虫

红内期的研究在1976年前仅限于人和一些动物疟原虫的短期保存，尚不能连续培养。早期的探索虽然应用的原则如稀释和连续流灌等方法和以后成功的方法相似，伹有很多不同。

Trager和Jensen认为下述条件为恶性疟原虫培养成功所必需，一个人红细胞薄层(例如，10%红细胞悬浮液1ml置于3.3mm?面积内所形成的薄层），一层3mm厚的RP-MI-1640培养液（每升培养液内含100mJ与红细胞相应的血清），2～5%，和5～10%的混合气体，间断或缓慢连续地更新培养液及随疟原虫率的增加补充新鲜正常红细胞。

这些条件可以由许多途径来获得，最简单的是用Petri培养皿在蜡烛缸内培养。但使用这一方法每天至少要人工换液1次，原虫率超过5%时甚至需要多次。Osisanya等指出如果培养液内葡萄糖浓度增加1倍，混合气体比例为5%CO，和5%0，，使用TES缓冲液，则换液次数可以减少?Trager的连续流灌培养法可以获得连续的较稳定的原虫率。这种方法使培养液在固定的红细胞薄层上流动，培养液贮存瓶一周换一次即可。目前已进一步改进设计出一些复杂程度不等的半自动设备，这些培养系统内PH值可以恒定，并可以自动清除废物及提供新鲜培养液。

悬浮培养法连续培养可以提高原虫率，相应减少劳力。Butcher和Zoly等声称用悬浮培养法获得的最终原虫率比静止法髙。他们认为这是由于悬浮法培养时红细胞重复感染减少及原虫感染的红细胞的微环境内乳酸浓度下降的结果。然而Jensen和Endens却认为这两种方法效杲差不多。

二、影响恶性疟原虫红内期连续培养的因素

培养液

Trager和Jensen在一开始连续培养恶性疟原虫时就使用了RPMI1640培养液。这种培养液原来是用于培养人白细胞的。培养液内加入了25mM/LHEPES增加了溶液的缓冲能力^Haynes和Chen等人则使用添加补充成份的199培养液。Divo和Jen-sen对RPMI1640，Ham氏营养混合液F-12和含有Eagle或Hanks盐溶液的199培养液进行了比较，发现对于培养恶性疟原虫来说RPMI164比两种199培养液好，与Ham氏F-12液的效果相等。

疟原虫体外培养时PH值保持在7.3~7.5间很重要。恶性疟原虫培养的成功需要有一恒定的pH环境，这一pH值是疟原虫代谢产生大量乳酸所引起的整个和局部PH改变的总和。两个成功培养例子中，采用的疟原虫密度都较低，只有早先不成功的1/4-1/2，这就明显减少了培养时的乳酸盐产物。此外，使用了一种两性离子缓冲液HEPES，可以对CO，/NaHCO，缓冲系起辅助作用。HEPES和TES都是良好的缓冲剂，因为在37°C时它们的Pk，分别为7.31和7.50，与疟原虫生长的最适PH十分接近。两性离子缓冲剂还有一个优点，即在疟原虫生长需要较高，浓度环境下可以保持培养物的PH值稳定。

三、气体相

气体相的组成对于疟原虫的发育也是一个关键。2-5匁CO，浓度对连续培养中疟原虫生长无显着影响，但浓度过髙对培养有抑制作用。这可能是直接影响了正常PH范围的维持，因为RPMI1640培养液内有一组CO，/NaHCO，缓冲系。其他哺乳动物疟原虫在代谢过程中有结合，现象，所以恶性疟原虫也可能利用CO，进行代谢。

5～10%，浓度适合于疟原虫连续培养，但高浓度的氧（相当于空气中的氧浓度〉却有抑制作用，虽然这种作用有时需要几天后才能观察到。氧对于疟原虫代谢的作用还不清楚，似乎低氧张力有利于培养过程中低氧化还原势的维持。各种维持低氧化还原势剂对于短期培养的作用是很不相同的。然而有趣的是Haynes和他的助手所用的改良的199培养液中却含有2种还原剂2-巯基乙醇和维生素E。但疟原虫在完全无氧环境中连续培养没有成功过。

为了使PH值相对恒定及保持低氧化还原势，培养皿内气相与液相间需要有足够的交换。所以气体在培养液内的溶解度，培养液的深度，红细胞的浓度(也即细胞层的厚度〉和气体溶解度对于保证充分交换是至关重要的。恶性疟原虫培养的成功与这些互为相关的因素所起的作用分不开。在髙原地区药物敏感性的微量测试所以失败，可能与以上这些因素有关。

四、血清

成功的恶性疟原虫红内期连续培养使用了含150mI/LAB型人血清的完全培养液。所以选用这一型血清是由于它不与猴红细胞发生凝集。其实只要与培养所用的红细胞相适应>其他任何型血清都可以应用。15〇ml/LAB型血清对于建立新分离株的培养是很必要的，但在维持已建立的培养时这一浓度并不是不可变的。Jensen发现人血清支持疟原虫生长的能力不一，有些情况下只端要50ml/L浓度或更低。最近Divo和Jensen指出如果>将20个或20个以上志愿者的血清收集在起，那么50mI/L的血清就足以获得最佳的原虫生长率。含25moL混合血清的培养液也可应用于连续培养，但获得的生长率只有最佳率的50%左右。从当地血库或新鲜收集来的血淸都应该贮存于-20°C或冻干，但反复冻融的血清不利于培养。Druilhe等认为脐带是培养疟原虫血清的最好来源，Jensen也证实了这一点，但获得这种血清需与当地医院产科部门密切合作，使用人血清虽然可以使连续培养的恶性疟原虫生长达到最佳状态，但这种对人血清的依赖也有许多缺点，首先人血清代价较大，获得不易，而且在疟疾流行区得到的血清往往含有某些免疫抑制因子，此外尽管不是十分重要，需提及的是接触血清有感染肝炎病毒和其他病原的危险。因此寻求人血清的替代品显得十分重要。

最初企图用现有的商品动物血清替代人血淸，但没有成功。然而Ifediba和Vander-berg：却报道了可以用商品小牛血清加100ml/L再生蛋白胨或豚胨150g/L代替人血清。但疟原虫对这一新环境需要有9个月的适应过程。用加入小羊和猪血清的培养液培养疟原虫时仅观察到少数几代增殖，不能连续培养。而经热灭活的马、小牛和新西兰白兔血清可以维持连续培养。Butcher曾报道一株实验室恶性疟原虫经过一段适应过程在用100ml/L马血清的EPMI1640培养液中培养了4个月。Sax和Rieckmann也认为在使用50m]/L库存兔血清连续培养时需要有一适应过程；但用库存的小牛血清加次黄嘌呤建立苏丹恶性疟原虫分离株连续培养前毋需适应过程，最近报道越南Smith和马来亚Camp恶性疟原虫株可以在无血清的培养液内连续培养4周。用含有脂肪酸（即顺-十八烯酸、油酸和亚油酸）和无脂肪酸小牛血清白蛋白培养液培养疟原虫，虽然生长率较用血清的为低，但可连续传代用含有其他脂肪酸包栝硬脂酸培养液培养疟原虫是否会产生同样结果，有待进一步观察。

五、釭细胞

ABO型红细胞皆适于连续培养恶性疟原虫，但在研究红细胞表面裂殖子受体时发现与血红蛋白型有关的各种因子、各种基本的酶及膜的一些特征在连续培养过程中对裂殖子的粘附和疟原虫的存活起着决定性作用。因此，可以推测只要用无Rh蛋白的，不属于Kell、Jk、Tn、Ge和S-s血型的红细胞培养恶性疟原虫都可获得相同的生长率。相反，缺乏较多的红细胞唾液酸糖蛋白、血型糖蛋白的红细胞，例En阴性红细胞就不能应用于培养，因为用这种红细胞短期培养时恶性疟原虫再侵入率减少。最近还观察到恶性疟原虫连续培养多代后可以适应于缺乏6-磷酸葡萄糖脱氢酶的红细胞。

早期的研究表明用于恶性疟原虫连续培养的红细胞应置于4°C冰箱内，贮存于柠橡酸葡萄糖(ACD)和柠橡酸磷酸葡萄糖(CPD)中，并认为用这种方法贮存4周的红细胞比新鲜红细胞更有利于原虫生长。现在看来情况并非如此，只要红细胞内三磷酸腺苷(ATP>的水平在正常范围内，新鲜红细胞与贮存红细胞同样适于连续培养。最近还发现无免疫供血者的白细胞不影响疟原虫体外发育，因此，可以不必去除它们。有些去除白细胞的方法，例如WhatmanCF-11纤维素柱的应用可能反而对培养不利。

六、疟原虫分离株

自1976年以来，世界上不同地区的许多分离株已在实验室内建立。虽然大部分分离株的培养是成功的，但并不是所有株都容易适应于体外生长。有些地区的原虫株建立培养相当困难。Trager认为这并不是由于疟原虫的遗传特性不同而可能是技术不过关造成的。

建立培养可以用新鲜感染血，也可以用4℃贮存一段时间的含虫血或用-70°C甘油低温保存的除去保护液的含虫血来进行，一般来说从已建立培养的疟原虫来进行再培养较直接培养现场分离株要容易些。疟原虫分离与建立培养之间的时间，含虫血的原虫率，运输的方式及条件和低温保存及复苏的方法和操作，这些因素对建立培养均有影响。

不管怎样，直接自病人血取原虫建立培养，都需时4~6周，这一适应时间与真核组织细胞的培养相似。

恶性疟原虫红内期无性体体外连续培养后形态保持正常。在培养时可见到各发育阶段的原虫，这是因为疟原虫失去了体内同步发育的特征。这对某一特定阶段的免疫学和生物化学研究带来一些困难。然而可以用生理胶、明胶或聚蔗糖等简单方法收集成熟的红内期原虫，用50g/L山梨醇溶液洗涤感染红细胞可获得环状体。山梨醇能溶解含成熟原虫的红细胞，但对环状体感染的红细胞无作用。用上述方法分离获得的原虫，继续培养时至少能保持2~3代的同步发育，但以后又变得不同步了。所以目前有必要研究长期维持同步的方法。

没有迹象表明体外长期培养后疟原虫会丧失感染性，疟原虫在几个培养系内体外培养3年后仍可感染夜装。此外也瞥报道恶性疟原虫FCR-3株培养大约4年后偶然感染了人。

然而有证据表明在培养期间原始分离株的一些特征可能发生改变。此外，某些分离株需一定时间适应体外培养的事实表明，可能是经历一个选择过程。这并不奇怪，因为其他真核细胞在体外培养时也有类似情况发生。例如FCK^3株刚分离时和体外培养年后对气喹是敏感的，然而经4年培养后，发现该分离株虽没有处于气喹的压力，但经体内外证实，却对气喹产生了抗性，然而其机理是在培养过程中发生了抗性突变，或者存在于原始株的抗氯喹克隆由于体外生长的生物学优势，随时间的推移而迅速增长的缘故，目前还不清楚。

在连续培养条件下，发现恶性疟原虫可出现形态变化。Langretli等首先报道了这一情况，他们观察到恶性疟原虫用蜡烛缸法培养18个月后发生了变异，这种变异疟原虫寄生的红细胞膜表面不再出现结节。Motyl和Reece还发现在培养时不引起结节(K一)的变异疟原虫比引起结节(K+)的疟原虫虫率髙，与同位素标记的异亮氨酸结合较快，多重感染细胞的百分率也较髙。这样看来疟原虫具有体外生长的生物学优势。但每4周用一种能浓集有结节红细胞(K+细胞〉的明胶技术配合山梨醇的溶解，就几乎能完全保持细胞上有结节的K+原虫系。

恶性疟原虫在生物学特性方面的异质性问越，最早是Carter和voller提出的。他们发现非洲和东南亚病人的阳性血内有一些变异酶。很明显，认识这种异质性在流行病学上很重要，对近来体外研究疟原虫克隆化也很有帮助。恶性疟原虫的克隆可以用有眼稀释技术获得，这一点已由显微镜观察稀释的培养物微滴和最近的微量操作技术所证实。用Oduok方法在1小时内可以分离单个感染细胞5·10次。这种方法经连续培养建立克隆的成功率为30?50%，由单个感染细胞建立的克隆大约在培养21天内可从吉氏液染色的血片上发现原虫，Thaithong应用这一方法证实了一个抗气喹、乙胺嘧啶和周效磺胺-乙胺嘧啶合剂的恶性疟原虫T·分离株。

七、药物抗性和群体内传播机制的遗传学研究

药物抗性问题是疟疾控制的主要障碍，但关于抗性出现及其在人群中传播的机制目前还不清楚。可能有许多机制包括疟原虫对药物的非遗传性适应或在药物作用下遗传性的改变等等。目前遗传学方面的研究主要用鼠疟为模型在体内进行。体外培养技术和具有多种抗药性的恶性疟原虫克隆的研究表明来源于不同国家的疟原虫遗传学上是相似的，这可能是存在着一种世界范围内的种间

杂交群。用培养的方法还证实抗气喹株疟原虫比敏感株具有生物学优势，抗性分离株包含着药敏程度不同的许多克隆，当然也包括了敏感克隆。至于药物敏感株中是否含有抗性克隆，尚有待于进一步证实。

目前，培养技术和重组DNA分析及基因克隆正被应用于药物抗性遗传学基础的研究。此外，由于红内期和红外期体外培养的成功，可以得到对蚊虫有感染性的疟原虫，这样就有可能开展一些典型的孟德尔方法的遗传学工作。

八、抗原产生

虽然疟原虫培养并不是用作今后疟疾疫苗抗原的来源，伹红内期的培养确实为免疫诊断提供了很有价值的抗原。实验室用能够保持人疟原虫的猴子作为抗原来源，一则化费太大，再则获得的材料也太少。疟原虫全虫抗原可以由同步培养的血片获得，可溶性抗原则可以经疟原虫溶解或收集培养上清液获得。目前在标准条件下恶性疟原虫是唯一能在体外获得大量抗原的人疟原虫，但应当记住各分离株间可能存在着不同的抗原。很有必要研究其他的人拒原虫体外培养方法。在缺乏这些方法时，异种抗原也可用于血清学研究，例如现在体外能够培养的食蟹猴疟原虫可以在以间日疟流行为主的地区应用。

九、保护性免疫的测定

现有资料显示特异性抗体在介导保护性免疫时可能起重要作用，在体内要杀灭疟原虫可能还需要有致敏的效应细胞配合。体外裂殖子抑制技术已被应用于测定保护性抗体的血清，但这一技术对于疟疾流行病学的应用尚待进一步证实。所有应用的方法都关系到培养的恶性疟原虫裂殖子对红细胞的入侵作用被血清抑制的程度。这种作用可以通过直接计数常规染色血片上原虫，通过放射活性的异亮氨酸的摄取，或用荧光标记方法、流动细胞荧光计和荧光激活细胞分类器来测定。总之，所用的方法与药物敏感性测定方法相似，亦以微量培养系统为基础。

在原虫与血清相一致的同质系统中，这些方法所获得的结果通常能与宿主的保护免疫状况相符合。在疟原虫和抗血清不可能适应的现场条件下应用这些抑制试验得到的结果往往不能精确地反映保护性的状况。例如Jensen等发现在苏丹所有“有免疫力”的成人血清一定程度上抑制裂瘦子入侵，阻滞引起疟疾疟状的虫体的生长，而Cowaix等发现所测定的血清只有43%有抑制作用，尽管这些血清也是采自居住在流行区，荧光免疫测定怔实有疟疾抗体的成人。“有免疫力”的血清有时还能增进体外培养。这些现象也许表明，在现场流行的疟原虫呈现.出相当大的抗原多样性的地区，测定保护性免疫状况是很困难的，同时也表明保护性免疫反应不仅仅是体液反应。

Udeinya等研究出另一种测定保护性抗体的体外测试法。这一方法是根据滋养体和裂殖体感染的红细胞有粘附现象。体内粘附现象是通过红细胞表面结节起作用的。hya等发现体外这些有结节的细胞也可以粘附到培养的脐静脉内皮细胞上或无黑色素的黑色素瘤细胞系的细胞上。这种粘附被株特异性的免疫血清所抑制。用人免疫血清测定不同地理区域疟原虫都获得相同结果。伹这种体外方法作为保护性免疫指标的价值还需进一步研究。

测定子孢子和配子体的保护性免疫方法，从理论上来说，在建立这些阶段的体外培养基础上是可以设计出来的。

作者：Trigg PI