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中药毒理学的研究论文(共2篇)


第1篇:骨折中中药毒理学的研究


骨折是常见的外伤性疾病,随着社会的发展,其发生率越来越高。祖国医学运用中药治疗骨折有着悠久的历史[1],中药局部外用治疗骨折更是常用的方法之一。在局部外用治疗过程中,药物的局部安全性影响了患者的依从性,进一步影响疗效。但综观国内外对中医治疗骨折的研究,多注重疗效及机制[2-4],而对药物的安全性重视不够。驳骨黄水是广东省湛江市第二中医院针对骨折的病理特点,根据民间验方研制开发的外用医院制剂。在湛江市第二中医院临床应用了二十多年,观察了数千例患者,取得了满意疗效。为了进一步的开发应用,本文按照新药的有关要求,对该药进行了毒理学研究。


1材料与方法


1.1材料试药驳骨黄水(湛江市第二中医院提供,每毫升含生药0.6g);2,4-二硝基氯苯(CP级,北京市兴津化工厂,1%的致敏浓度和0.1%的激发浓度)。


实验动物昆明种小鼠(体重18~22g,雌雄各半,广东医学院实验动物中心提供);成年白色家兔(6只,体重2.0~2.5kg,雌性,广东医学院实验动物中心提供);健康成年白色豚鼠(体重250~300g,雌雄各半,南方医科大学实验动物中心提供)。


1.2实验方法急性毒理学研究根据预试验结果,取昆明种小鼠70只(雌雄各半),雄性体重为(19.2±1.1)g,雌性体重为:(19.1±0.8)g,禁食6h。随机分为7组,每组10只,按11.560,10.660,9.826,,8.352,7.702,7.099ml/kg的剂量分别一次性腹腔注射给药,观察7d,记录毒性反应和死亡情况。


皮肤的刺激性试验成年家兔正常皮肤的刺激性试验成年家兔3只,每只家兔去毛区随机分为给药区和对照区,给药区涂抹驳骨黄水0.5ml,对照区涂抹蒸馏水0.5ml。用保鲜薄膜覆盖,纱布包扎固定,6h后去除覆盖物,于清除局部受试物后1h观察涂药部位有无红斑、水肿等情况,每日涂药和观察1次,连续7d。


成年家兔破损皮肤的刺激性试验成年家兔3只,家兔背部脊柱两侧去毛区用针头划出“#”形擦伤,不伤真皮,以有轻度渗血为度,痕间距约0.5cm。其余操作方法同“1.2.2.1”项下正常皮肤的刺激性试验。


评分标准每只动物实验结果按表1进行刺激反应评分,计算平均值,按表2进行刺激强度评价。试验最后1d,观察结束后处死动物,切下局部皮肤,福尔马林固定,HE染色,镜下检查,观察炎症细胞浸润情况和其他病理改变。


皮肤过敏性试验30只豚鼠随机分3组,分别为阴性对照组、驳骨黄水组、阳性对照组。实验前24h,将豚鼠背部脊柱两侧去毛,左右两侧去毛面积为3cm×3cm。


致敏接触:阳性对照组取1%2,4-二硝基氯苯的丙酮溶液0.1ml涂在豚鼠背部左侧去毛区皮肤上,用保鲜薄膜覆盖,纱布包扎固定,6h后去除覆盖物,并用酒精棉球拭去2,4-二硝基氯苯。7d和14d以同样方法重复一次,共计3次。阴性对照组和驳骨黄水组分别用0.9%氯化钠注射液0.1ml或驳骨黄水0.1ml,按同样步骤作致敏接触。


激发接触:于末次给药致敏后14d,驳骨黄水组将驳骨黄水0.1ml涂在动物背部右侧去毛区,用保鲜薄膜覆盖,纱布包扎固定,6h后去除覆盖物,于0,24,48,72h观察皮肤过敏反应,同时密切观察豚鼠是否出现哮喘、站立不稳或休克等严重全身过敏反应。阴性对照组用0.9%氯化钠注射液0.1ml,阳性对照组用0.1%2,4-二硝基氯苯的丙酮溶液0.1ml,涂于右侧去毛区,作激发接触。按表3评分,计算皮肤反应平均值和致敏发生率,致敏发生率的计算是将出现红斑、水肿、全身过敏反应(不管严重程度)的例数除以受试动物总数。


2结果


2.1急性毒理学研究本制剂是外用给药,为研究其急性毒理学,故进行急性腹腔注射毒性试验。结果显示,小鼠腹腔注射大剂量驳骨黄水后多直接进入抑制状态,注射小剂量驳骨黄水部分先出现兴奋不安,两三分钟后转入抑制、昏迷;最后有的小鼠死亡,死亡小鼠解剖,肉眼及镜下心、肝、脾、肺、肾脏器无异常。存活小鼠一般都在3h内苏醒。经计算,小鼠腹腔注射驳骨黄水的半数致死量(LD50)为9.25ml/kg,折算为人的等效剂量是1.03ml/kg。


2.2皮肤的刺激性试验每日涂驳骨黄水1次并封包6h,于清除受试物后1h观察皮肤刺激反应情况,连续7d。3只兔正常皮肤和3只兔的破损皮肤,皮肤的刺激反应评分最高总积分值均为0,见表5和表6。按照皮肤刺激评价标准,驳骨黄水属无刺激性物质;在镜下观察也均未见有炎症细胞浸润和其他病理改变。


2.3皮肤过敏性试验给予驳骨黄水全部受试动物,在观察的72h内均未出现皮肤过敏反应,致敏发生率为0,属无致敏性物质;阳性对照药2,4-二硝基氯苯在激发接触后即出现明显的过敏反应,致敏发生率为100%,属极度致敏性物质。3讨论驳骨黄水的组成主要包括:活血化瘀药(红花、血竭),消炎止痛药(洋金花、黄连粉、黄柏)。活血化瘀类药物能抑制血小板聚集,抗血栓形成,降低全血黏度及红细胞聚集度[5],从而改善局部的血液循环,促使血管重建,使骨折导致的血运障碍恢复,从而有利于骨折的愈合。消炎止痛类药能减轻骨折部位的炎症渗出,减轻疼痛,使主动活动关节及下床功能锻炼得以提前。驳骨黄水外敷能减轻骨折部位的肿痛,加速骨折的愈合,已被临床证实[6]。


家兔皮肤刺激性试验和豚鼠皮肤过敏性试验是检查药物局部刺激性和过敏性的经典方法。本文的研究证实,驳骨黄水对家兔正常皮肤和破损皮肤无刺激,对豚鼠皮肤无过敏性,说明驳骨黄水外用的安全性。同时,为了观察驳骨黄水的急性毒性,我们还进行了小鼠腹腔注射急性毒性试验,结果提示驳骨黄水腹腔注射有一定的毒性,说明只能外用,不能内服,其急性毒性产生的机制主要是洋金花对中枢神经系统的抑制所致。


综上所述,驳骨黄水在临床应用中,对骨折愈合有良好的疗效,动物毒理学的研究证明了外用是安全的,为进一步的药效学的深入研究提供了前期工作。


作者:林赤,陈康远,周俊德


第2篇:中药免疫毒理学的临床研究


过敏反应是中药注射剂的主要不良反应,也是最严重的不良反应。过敏反应又称Ⅰ型变态反应,即超敏反应(hypersensitivity),是变态反应中最常见的类型,由IgE介导。另外,中药注射剂的不良反应还有一类称为类过敏反应(anaphylactoidreactions),临床上常常被认为是过敏反应。类过敏反应是药物等抗原首次刺激机体产生的类似超敏样反应的病理过程,不通过IgE介导,具有剂量依赖性,但临床表现与超敏反应相似[1]。超敏反应和类过敏反应的临床表现相似,较难从症状上区分;但其发生机制不同,临床预防和应对措施也各不相同。因此,探讨中药注射剂过敏反应的类型及其发生特征具有临床意义。本研究依托前瞻性安全性主动监测设计了巢式病例对照研究,采集过敏患者及匹配患者血样,通过血清样本的免疫毒理学测定来分析过敏反应类型,为临床应对中药注射剂的超敏反应和类过敏反应提供参考。


1材料与方法


1.1研究对象使用中药注射剂后发生过敏反应的患者和未发生过敏反应的匹配患者。本研究涉及的中药注射剂包括:疏血通注射液、灯盏细辛注射液、参芪扶正注射液、参麦注射液、刺五加注射液、痰热清注射液、热毒宁注射液和舒血宁注射液。


1.2试验设计采用多中心、大样本、登记注册式医院集中监测嵌套巢式病例对照的临床试验设计。


将使用中药注射剂的患者确定为研究队列人群,依托登记注册式研究记录研究队列人群中每个患者的人口学信息和用药信息,观察其住院期间的不良反应/事件,将住院期间发生过敏反应的患者作为过敏组,以性别相同、年龄±5岁、用药季节相同、药品批次相同为匹配条件,住院期间未发生过敏反应的符合匹配条件的患者中按1∶4随机抽取对照组。


不良反应/事件判断标准:采用美国国立变态反应和感染性疾病研究所(NIAID)与食物过敏及急性全身过敏反应联盟(FAAN)在第二次专题讨论会上制定的急性全身过敏反应的诊断标准。


1.3血样采集、处理和保存当发现使用被监测中药注射剂而出现过敏反应的患者,立即(5min之内,最迟不能超过30min)使用4mL血清管1支、双向采血针及持针器采集静脉血4mL;血样在室温放置30min,使血清析出;将采血管放入离心机中,3000r·min-1离心5min,以无菌吸管/移液器将血清装入EP管,每管存量1mL,写上患者编码。冷链(≤-20℃)送至中心实验室,放置于-80℃冰箱中保存。匹配患者采血流程与过敏患者相同。


1.4血样检测检测指标补体C3,补体C4,免疫球蛋白E(IgE),免疫球蛋白G(IgG),肥大细胞类胰蛋白酶-β(MCT-β)。


检测方法双抗体夹心ABC-ELISA法。


试剂盒人补体C3(C3)ELISA试剂盒,上海西唐生物科技有限公司;人补体C4(C4)ELISA试剂盒,上海西唐生物科技有限公司;人免疫球蛋白E(IgE)ELISA试剂盒,上海西唐生物科技有限公司;人IgG定量EIA试剂盒,上海西唐生物科技有限公司;人类胰蛋白酶β(MCT-β)ELISA试剂盒,上海西唐生物科技有限公司。


检测仪器酶标仪:DENLEYDRAGONWellscanMK3,Thermo,分析软件为AscentsoftwareforMultiskan;洗板机:Wellwash4MK2,Thermo;数字显示隔水式电热恒温培养箱:PYX-DHS,上海跃进医疗器械厂;离心机:TGL-168,上海安亭科学仪器厂;漩涡混合器:XW-80A,上海青浦沪西仪器厂;电热恒温鼓风干燥箱:DHG-9023A,上海精宏实验设备有限公司;连续分液器:0.1~50mL,TOMOSLIFESCIENCEGroup。


2结果


2.1血样采集情况共采集到14例过敏反应患者的血清样本,按照巢式病例对照研究匹配原则,共匹配了55例患者,基本信息见表1。


2.2检测结果5项免疫毒理学指标检测结果见表2。


2.3过敏反应类型判断根据补体C3,C4,IgE,IgG,MCT-β判断过敏反应的类型。如果补体C3异常升高,C4不升高,则判断为类过敏反应;如果IgE异常升高则为Ⅰ型变态反应;如果IgE不升高,但IgG异常升高,则判断为迟发型变态反应;如果补体C3,C4无异常变化,IgE也未异常升高,但MCT-β异常升高,则为类过敏反应。判断结果见表3。


3讨论


3.1本研究监测的中药注射剂过敏反应以Ⅰ型变态反应为主中药注射剂过敏反应主要有Ⅰ型变态反应和类过敏反应。有学者认为类过敏反应是Ⅰ型超敏反应的亚类[2]。对于类过敏反应的激发途径,有学者认为外界刺激直接激发肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒[3],也有学者认为是通过激活补体系统,经由级联反应诱发肥大细胞脱颗粒[4]。因此,本研究通过补体C3,C4,IgE,IgG和MCT-β5项免疫毒理学指标判断不良反应发生类型。


本研究监测的8种中药注射剂临床过敏反应的类型主要为Ⅰ型变态反应(6例确定),也有类过敏反应(2例确定)。除此之外,尚有表现为过敏反应,但从免疫毒理学指标上既不归属于IgE介导的Ⅰ型变态反应,又不符合补体激活的类过敏反应,也不符合直接激发肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒的类过敏反应者。可以确定类型的过敏反应,Ⅰ型变态反应和类过敏反应的比例为3∶1。


无法判断类型的病例占全部病例的一半,这可能与血样采集的临床实际相关。基于临床的生物样本分析,受到很多因素的影响。首先是采血时间问题。当临床发生过敏反应,尤其过敏反应较重时,临床医生必然是以抢救患者为先,临床采血要放于次要地位,往往不能及时采血,因此血液指标不能反映患者过敏反应时的即刻状态。然后是用药问题。抢救患者时,往往用药较多,而大量抢救药物都会改变患者的免疫状态;事实上,往往是患者已脱离过敏状态,临床医护人员才会出于科研考虑而采血,因此,血样往往反映的是被纠正后的免疫状态。这可能是许多组数据杂乱,缺少规律,无法判断不良反应类型的原因。


3.2过敏反应类型与注射剂品种密切相关从可明确过敏反应类型的7例患者的血样结果来看,同一注射剂发生过敏反应的类型应该是确定的。疏血通注射液2例过敏反应,1例明确为Ⅰ型变态反应,1例不能确定;灯盏细辛注射液3例过敏反应患者,2例明确为Ⅰ型变态反应,1例不能确定;参芪扶正注射液4例过敏反应,3例明确为Ⅰ型变态反应,1例未知;参麦注射液仅有1例,为类过敏反应。


中药注射剂类过敏反应研究较充分。有学者以C48/80为工具药建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型开展了参麦注射液过敏反应机制研究,发现参麦注射液的脱颗粒作用可能与所含溶剂聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)有关[5]。


3.32种类型过敏反应同时发生的分析第3组灯盏细辛注射液的过敏患者同时发生了Ⅰ型变态反应和类过敏反应。该组过敏患者IgE水平异常升高,但同时补体C3水平也异常升高,C4水平基本未升高,这既符合IgE介绍的Ⅰ型变态反应,又符合补体激活的类过敏反应,2种过敏反应类型在同一患者身上同时出现。


4结论


从本研究监测的8种中药注射剂来看,过敏反应的类型以Ⅰ型变态反应为主,类过敏反应相对较少,2者比例约为3∶1;中药注射剂过敏反应类型与注射剂品种本身密切相关,同种中药注射剂的过敏反应类型可能是确定的;灯盏细辛注射液可同时发生Ⅰ型变态反应和类过敏反应。


作者:王志飞,艾青华,黎元元,姜俊杰,王连心,杨薇,谢雁鸣

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