近二十年来，分子遗传学的一系列成就，不仅推动了分子生物学和基础医学的发展，而且对遗传疾病的诊断和治疗，也应用了分子遗传学的新技术如分子杂交、内切酶、DNA重组等进行了探索，并获得了有意义的结果。生物遗传的基本单位是基因，其遗传信息贮存在DNA(去氧核糖核酸)分子的碱基序列之中。结构基因就是决定特殊蛋白质遗传密码的DNA的一个片段。

　　一、运用单细胞双重巢式PCR和MDA技术方法行性连锁遗传病诊断

　　方法1、提取男女单个淋巴细胞各150例，共300个细胞。随机分成3组，每组男女细胞各50个，双重巢式PCR技术在单细胞水平同时扩增X-类固醇硫酸脂酶基因(steroid sulfatase gene， STS)/Y-假基因和牙釉质基因(Amelogenin，AMEL)，对照组用单重巢式PCR技术在单细胞水平分别扩增两基因，比较单、双重巢式PCR技术在单细胞水平的扩增率及性别诊断正确率。2、应用MDA扩增5个单个淋巴细胞和10个单个卵裂球全基因组DNA，1%的琼脂糖电泳检测扩增效率，通过普通PCR即上述巢式PCR的第二轮的PCR条件检测细胞性别来判断扩增产物的均一性。结果1、单重巢式PCR扩增男性细胞STS和AMEL的扩增率和细胞性别诊断的正确率分别是84%、76%和84%、84%;而双重巢式PCR技术同时扩增上述基因的扩增率和性别诊断正确率分别为98%、96%。后者与前两者相比扩增率和性别诊断正确率均明显提高，差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。2、MDA扩增5个淋巴细胞(3个为男性细胞，2个为女性细胞)全部扩增成功，扩增率100%;MDA扩增10个卵裂球有4个扩出产物，扩增率为40%。以MDA产物为模板，用STS的第二轮引物检测单个淋巴细胞性别，正确性为100%;检测所有扩出产物的卵裂球也均能检测出性别，发现2个为男性，2个为女性，可惜的是这4个卵裂球均来自不同的胚胎，所以不能相互验证。从淋巴细胞MDA产物检测的结果可以判断MDA产物也是均一的。结论1、在单细胞水平性连锁遗传疾病诊断中，双重巢式PCR技术较单重巢式PCR技术具有较高的扩增率及诊断正确率，并有助于发现等位基因脱扣(allele dropout， ADO)。该法在无创性单基因伴性遗传病的产前诊断和植入前遗传学诊断中具有较高的实际应用价值，且经济、便捷，值得临床进一步推广。2、初步预实验可知MDA可以克服单细胞的模板量少和不可重复实验的缺点。但由于此次预实验的样本量太小，其稳定性、可靠性还需进一步摸索，才可以用于单基因病的着床前遗传学诊断和产前诊断。

　　二、利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA进行无创性地中海贫血产前基因诊断的研究

　　方法：收集157例孕妇的外周血，利用柱吸收的方法提取血浆中的cffDNA，经琼脂糖凝胶电泳分离富集小片段cffDNA，使用二重PCR反应(dulex-PCR)检测SRY基因和磷酸甘油醛脱氢酶(glycerol-dehyde-phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因。结果来源于86例孕男胎的孕妇血浆标本的小片段cffDNA均检出SRY和GAPDH基因，来源于71例孕女胎的孕妇血浆标本的小片段cffDNA只检出GAPDH基因。与绒毛/羊水标本检测结果以及产后随访结果相符。特异性和敏感性分别为100%(157/157)和100%(86/86)。结论利用琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，可以选择性富集孕妇外周血中的小片段cffDNA，相对地提高胎儿DNA的含量，结合二重PCR扩增SRY基因技术可用于无创性产前性连锁遗传疾病和单基因突变疾病的产前诊断。第二部分利用孕妇外周血浆中cffDNA进行STR-PCR检测胎儿基因型目的：利用小片段cffDNA进行D5S818、D7S820、D13S317三个短串联重复序列(short tandem repeat，STR)基因型的分析，观察提取出来的小片段cffDNA中母源性DNA背景对实验的影响。方法：收集了62例孕妇外周血标本，提取小片段游离胎儿DNA，利用多重PCR(mutilplex-PCR)的方法分析胎儿的STR基因型，并与父母基因型相比对。结果：62例小片段cffDNA的扩增结果中，49例标本的扩增结果完全与父母基因型相匹配，未发现母源性DNA的污染。其余13例在D13S317基因座的扩增中出现了母源性DNA的污染。结论：经过对小片段cffDNA进行富集后，仍有可能出现母源性DNA对实验的影响，并且可能影响对实验结果的判读。使用多重PCR反应结合多基因座的扩增，可能可以有助于减少母源性DNA的影响，有助于结果的判读。第三部分利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA进行β-地中海贫血无创性产前基因诊断目的：利用cffDNA对胎儿进行广西、广东地区常见的17种β-地中海贫血基因型的检测，与传统创伤性产前诊断相比较，探讨该方法的准确性和可行性。方法：针对广西、广东地区常见的β-地中海贫血突变的基因型设计三对不同引物，并用生物素标记。对cffDNA进行二次PCR反应后，使用反向斑点杂交(revert dot-blot hybridization，RDB)检测胎儿的β-珠蛋白基因型，与创伤性产前诊断结果比较，观察准确率。结果：37例cffDNA标本检测中，检出重型β-地中海贫血19例，轻型β-地中海贫血11例，正常7例，与创伤性产前诊断结果相比较出现3例误诊，准确率为91.9%(34/37)。结论：利用cffDNA进行β-地中海贫血的检测，可能出现母源性DNA背景的污染，当胎儿基因型与母亲基因型相同时，必须提高警惕，进一步分析或者复查。因为该技术取样容易，对孕妇胎儿无风险，不受孕期时间影响，易为与孕妇接受，因此进一步改进该技术后有望可用于β-地中海贫血的诊断。第四部分利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA进行巴氏水肿胎儿检测目的：通过检测cffDNA以及母源性cfDNA在PCR反应中扩增效率的不同，进行检测巴氏水肿胎儿(Hb Bart’s hydrops foetus)的方法学研究。方法：对来源于拟诊孕水肿胎儿孕妇的小片段cffDNA，进行荧光PCR(Fluorescence PCR)扩增，利用毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)技术判断两种产物峰面积比(peak area ratio)来检测巴氏水肿胎儿。结果：30例拟诊巴氏水肿胎儿的小片段cffDNA扩增结果提示，巴氏水肿胎儿两种产物锋面积比远远<1。而其他原因所致的水肿胎儿的cffDNA模板扩增结果显示两种产物封面值比近似等于1。结论：通过荧光PCR和毛细管电泳的方法，有望利用cffDNA进行巴氏水肿胎儿的无创性产前诊断。

　　作者：王谷仙 严璟 来源：人间 2016年21期